Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate de cellulose

Dernière modification
Vendredi 30 septembre 2016

Auteur : Didier Pol


Table des matières

  1. Protocole
  2. Résultats
  3. Solutions
  4. Fournisseurs

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1. Protocole

Le principe de la simulation utilisée est le même que celui décrit pour l'électrophorèse des hémoglobines sur gel d'agarose supporté correspondant à la distribution des hémoglobines A et S dans trois générations au sein d'une famille. Il est indiqué dans le document "Identification des phénotypes moléculaires et des génotypes par électrophorèse de l'hémoglobine" et ne sera donc pas repris ici où l'on se limitera aux particularités liées à l'utilisation de bandes d'acétate de cellulose comme support d'électrophorèse.

Les échantillons utilisés pour mener l'électrophorèse sont des solutions réalisées artificiellement avec des hémoglobines A et S du commerce dissoutes à raison de 2,5 mg/mL dans du tampon d'électrophorèse préalablement oxygéné par une agitation vigoureuse. Pour chaque "membre de la famille", on place dans un tube Eppendorf étiqueté 100 µL de solution. Les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbA sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine A, les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbS sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine S et les échantillons correspondant aux individus hétérozygotes sont constitués d'un mélange de 50 µL de la solution d'hémoglobine A et de 50 µL de la solution d'hémoglobine S. Un tel volume permet de réaliser une vingtaine de pistes d'électrophorèse.

  1. Mettre à tremper les bandes d'acétate de cellulose dans le tampon d'électrophorèse (tampon tris-véronal) pendant 10 à 20 minutes (fig. 1).
Figure 1 : Trempage
Trempage des bandes d'acétate de cellulose
  1. Essorer l'excès de tampon en plaçant les bandes entre deux feuilles de papier absorbant essuie-tout (fig. 2).
Figure 2 : Essorage
Essorage des bandes d'acétate de cellulose
  1. Placer la bande sur le portoir en veillant à disposer la face absorbante vers le haut.La bande doit être tendue et ses extrémités doivent dépasser suffisamment pour tremper dans le tampon une fois le support placé dans la cuve (fig.3).
    NB : Le dispositif de fixation de la bande sur le support varie selon les fabricants.
Figure 3 : Mise en place de la bande sur le support
Mise en place de la bande d'acétate de cellulose sur le support
  1. Remplir les deux compartiments de la cuve avec un même volume de tampon d'électrophorèse.
  2. Mettre en place le(s) support(s) dans la cuve (fig. 4).
Figure 4 : Bandes en place dans la cuve
Mise en place des bandes d'acétates de cellulose dans la cuve
  1. Prélever un échantillon et le déposer sur la bande, déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité, côté cathode (borne noire) en prenant garde que la bande soit bien horizontale et que l'échantillon ne coule pas (fig. 6). On peut prélever et déposer les échantillons soit avec une micropipette, soit avec un capillaire, soit avec un applicateur  comme celui présenté fig. 5 réalisé avec un bouchon et deux trombonnes pour permettre un dépôt linéaire
  2. Recommencer pour chaque échantillon en laissant un espace suffisant pour ne pas risquer la fusion des échantillons qui diffusent légèrement lors du dépôt. Utiliser un applicateur différent pour chaque échantillon ou sinon, bien nettoyer l'applicateur entre chaque dépôt.
Figure 5 : Applicateur
Applicateur pour dépose d'échantillon sur bande d'acétate de cellulose
Figure 6 : Dépôts effectués sur une bande
Dépôts effectués sur une bande d'acétate de cellulose
  1. Fermer la cuve, mettre sous tension et faire migrer environ 1 h sous 150 V (fig. 7).
Figure 7 : Cuve et générateur pendant la migration
Cuve et générateur pendant la migration électrophorétique
  1. Après migration, placer les bandes dans la solution de rouge ponceau pendant 10 minutes (fig. 8).
Figure 8 : Coloration
Coloration de la bande d'électrophorèse au rouge ponceau
  1. Décolorer le fond dans des bains successifs d’acide acétique à 5 %. Agiter le cas échéant pour accélérer la décoloration (fig. 9).
Figure 9 : Bains de décoloration
Décoloration de la feuille d'électrophorèse Décoloration de la feuille d'électrophorèse
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2. Résultats

L'hémoglobine S moins chargée que l'hémoglobine A en raison de la substitution d'un acide glutamique par une valine en position 6 de la chaîne de la bêta globine migre moins loin et peut ainsi être distinguée sur la bande d'acétate de cellulose (Fig. 10).

Figure 10 : Electrophorèse des hémoglobines A et S
Electrophorèse des hémoglobines A et S
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3. Solutions

  • Tampon tris-véronal
    Tris (hydroxyméthyl) aminométhane : 7,2 g
    Acide diéthylbarbiturique : 1,82 g
    Diéthylbarbiturate de sodium : 10,2 g
    Eau distillée : 1 L  Solution de coloration : rouge ponceau
  • Rouge ponceau : 2g
    Acide trichloracétique : 30g
    Eau distillée : 1 L
    Solution de décoloration
    Acide acétique à 5 %
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4. Fournisseurs

  • Kit électrophorèse
    SORDALAB
    ZA Des Poupettes
    91580 Villeuneuve sur Auvers
  • Kit "Drépanocytose"
    Hémoglobines A et S seules
    SIGMA
    L'Isle d'Abeau Chesnes
    BP 701 - 38297 Saint Quentin Fallavier
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Pour citer cet article

Électrophorèse des hémoglobines A et S sur bande d'acétate de cellulose, Planet-Vie, Mardi 5 juin 2012, https://planet-vie.ens.fr/electrophorese-hemoglobine-cellulose, voir