L’ADN néosynthétisé est marqué par un pulse de BrdU suivi d’une chasse thymidine. Lors du séquençage nanopore, les molécules sont déroulées en ADN simple brin et transloquées au travers de pores protéiques insérés dans une membrane soumise à un champ électrique. Les modifications du courant lors de la translocation sont enregistrées puis interprétées en séquence par un algorithme capable de détecter le BrdU (noté B) en plus des quatre nucléotides canoniques (A, T, C, G). Le taux de BrdU incorporé dans l’ADN est alors calculé tout au long des molécules séquencées. Lors de l’ajout de BrdU dans la culture, ce taux augmente rapidement, ce qui se traduit par une pente très forte marquant le début du pulse ; l’ajout de thymidine lors de la chasse dilue le BrdU et diminue son incorporation de façon plus progressive. L’asymétrie des pentes permet ainsi d’orienter les fourches de réplication et d’identifier les évènements d’initiation et de terminaison. On peut remarquer que la mesure du taux de BrdU est parasitée par des fluctuations de faible amplitude liées au processus de détection ; on parle de signal bruité. Les signaux réplicatifs présentés ont été détectés sur des molécules d’ADN extraites de la levure de boulanger, Saccharomyces cerevisiae. Les coordonnées génomiques sont indiquées sur l’axe des abscisses. ORI, origine de réplication ; TER, terminaison ; pb, paire de bases ; les flèches rouges indiquent le sens de progression des fourches.
Crédits image : B. Le Tallec et DataBase Center for Life Science, CC BY, Wikimedia (la séquence d’ADN a été modifiée et des annotations en français ont été ajoutées).