(A) Schéma du protocole expérimental de double marquage réplicatif de cellules en culture et exemple de signal théorique obtenu. L’ADN néosynthétisé est marqué successivement par un pulse d’IdU (en vert) puis un pulse de CldU (en rouge), dont l’incorporation est stoppée par l’ajout de thymidine (« chasse thymidine »). L’ADN extrait des cellules est ensuite étiré sur une lamelle de verre sur laquelle on procède à l’immunodétection de l’IdU et du CldU à l’aide d’anticorps spécifiques couplés à des fluorochromes. La molécule d’ADN complète (en bleu) est elle aussi révélée à l’aide d’un anticorps spécifique. La lamelle est ensuite observée au microscope. Les molécules d’ADN apparaissent sous la forme de lignes, y compris au niveau des régions répliquées. Les deux molécules filles présentes au sein de la bulle de réplication sont en effet juxtaposées lors de l’étirement.
(B) Signaux réplicatifs obtenus. Le double marquage permet de reconnaître et d’orienter les fourches de réplication, ainsi que d’identifier les évènements d’initiation (progression de deux fourches divergentes suite à l’activation d’une origine) et de terminaison (fusion de deux fourches de réplication convergentes issues d’origines voisines) de la réplication. Le type de signal correspondant diffère selon que l’évènement a eu lieu avant, pendant ou après le pulse d’IdU ou de CldU.
(C) Exemple d’image acquise au microscope après immunodétection. Les molécules d’ADN en cours de réplication ont été extraites de fibroblastes embryonnaires de souris et étirées par peignage moléculaire. Cette technique permet un étirement régulier des molécules d’ADN (2 kb par micromètre) et donc une mesure précise des paramètres de la réplication, en particulier de la distance entre origines et de la vitesse de progression des fourches. ORI, origine de réplication ; TER, terminaison ; les flèches grises indiquent le sens de progression des fourches.