Introduction

Avant-propos

La voie de dégradation ubiquitine dépendante fait partie de ces systèmes essentiels de la cellule dont l’existence était totalement ignorée il y a encore quelques dizaines d’années, et dont la découverte a bouleversé une partie de nos connaissances sur le fonctionnement cellulaire (comme a pu le faire la découverte des mécanismes de régulation du cycle cellulaire). L’importance physiologique de ce système a d’ailleurs valu à ses découvreurs le prix Nobel de chimie en 2004.

De nos jours, c’est l’un des sujets de recherche les plus actifs en biologie cellulaire. De ce fait, la situation s’est considérablement complexifiée depuis la première mise en évidence de l’existence d’une dégradation des protéines cellulaires selon un mécanisme nécessitant l’utilisation d’ATP. Afin de ne pas avoir une vision réductrice de cette voie, ce document fait une présentation assez large des connaissances actuelles sur le sujet, y compris des points sur lesquels demeurent des incertitudes ou des zones d’ombre.

Présentation générale

Le système Ubiquitine-Protéasome (UbPr) est au cœur de la plupart des processus biologiques, comme le cycle cellulaire, l’apoptose, la différenciation musculaire ou encore la réponse immune, notamment du fait de son rôle central dans la dégradation contrôlée des protéines régulatrices de ces processus.
Ainsi, le rôle de la protéolyse intracellulaire ne se cantonne pas à éliminer les protéines anormales ou endommagées, mais intervient dans la régulation fine des taux de protéines clés pour la cellule. Au vu de la multitude de substrats et des processus impliqués, il n’est pas surprenant que des dysfonctionnements de ce système soient impliqués dans de nombreuses pathologies, comme les cancers, les maladies neurodégénératives et les maladies auto-immunes.

La dégradation d’une protéine via le système UbPr implique généralement deux grandes étapes successives, qui nécessitent toutes deux l’hydrolyse de l’ATP (voir Fig.1).
Dans un premier temps, l’ubiquitylation consiste en la conjugaison covalente d’une ou plusieurs molécules d’ubiquitine (Ub), sur un ou plusieurs résidus lysine de la protéine, via une cascade enzymatique impliquant 3 types de facteurs : l’enzyme d’activation de l’ubiquitine (E1), l’enzyme de conjugaison de l’ubiquitine (E2) et l’ubiquitine-ligase (E3).
Dans un deuxième temps, le substrat ubiquitylé est ensuite adressé au protéasome 26S où il est dégradé. Le protéasome 26S est un complexe protéolytique d’environ 2 500 kDa formé par l’association du protéasome 20S (le cœur protéolytique de l’enzyme) au complexe régulateur 19S (voir Fig.1).
Au cours de cette deuxième étape, le substrat est déubiquitylé, ce qui permet le recyclage de l’ubiquitine, et il est dégradé en peptides qui seront par la suite digérés par des peptidases cytosoliques pour donner des acides-aminés. Ces derniers seront réutilisés soit pour la synthèse de nouvelles protéines, soit pour la production d’énergie pour l’organisme.
Certains peptides générés par le protéasome sont pris en charge par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I, dans le cadre de la présentation des antigènes. Enfin, certaines protéines ne sont que partiellement dégradées par le protéasome qui est donc impliqué dans la maturation protéolytique de précurseurs protéiques (comme le précurseur p105 de la sous-unité p50 du facteur de transcription NFkB ou Nuclear Factor-kappa B).

Ce schéma en deux grandes étapes du système ubiquitine-protéasome n’est qu’une vue simplifiée de ce système qui est en fait bien plus complexe. De fait, si certains substrats ne nécessitent pas une ubiquitylation préalable avant d’être dégradés, l’ubiquitylation ne mène pas toujours à la dégradation. Elle est en effet impliquée dans des fonctions indépendantes de la protéolyse comme l’endocytose, l’import nucléaire, ou l’activation de kinases par exemple.
En outre, le protéasome 26S et, plus particulièrement, les sous-unités ATPases du complexe régulateur 19S, sont associées à des fonctions non-protéolytiques.
Par ailleurs, le protéasome 20S peut également être associé à d’autres régulateurs (activateurs ou inhibiteurs) que le complexe 19S, ce qui lui confère des fonctions particulières.
Ces variations autour du modèle général présenté dans la Fig.1 illustrent la complexité du fonctionnement et de la spécificité du système UbPr et expliquent qu’il existe encore un grand nombre de « boîtes noires » dans notre connaissance de ce système.

Historique

Jusqu’au début des années 80, l’intérêt scientifique dans le domaine du contrôle de l’expression des gènes a porté essentiellement sur l’étude des acides nucléiques et la traduction des ARN messagers. La dégradation des protéines était peu étudiée, car elle était considérée comme étant non spécifique et non régulée. Bien qu’il fût connu que les protéines devaient être renouvelées, l’ampleur et la spécificité de ce processus, par lequel différentes protéines ont des demi-vies qui vont de quelques minutes à quelques jours, n’étaient pas appréciées. La découverte du lysosome par Christian De Duve en 1953 n’a pas significativement changé cette idée, en effet il était clair que ces protéases n’étaient pas spécifiques des substrats. Aussi, la découverte d’un mécanisme de protéolyse intracellulaire nécessitant de l’énergie a été accueillie avec scepticisme, car les protéases connues jusqu’alors fonctionnaient sans ATP (Simpson, 1953).

Pourtant, en 1977, Etlinger et Goldberg mirent en évidence un système protéolytique non lysosomal dépendant de l’ATP, en travaillant sur des lysats de réticulocytes qui ne contiennent pas de lysosome.
En 1978, Hershko et Ciechanover, en fractionnant ces extraits sur des colonnes de DEAE pour éliminer l’hémoglobine, observèrent que la fraction 1, constituée des protéines non retenues par la colonne, contenait un facteur nécessaire à l’activité protéolytique dépendante de l’ATP. Ils ont purifié ce facteur et l’ont identifié comme étant une petite protéine très stable d’environ 8,5 kDa, qu’ils ont appelée APF-1 pour ATP-dépendent Proteolysis Factor 1. Rapidement, ils se sont aperçus que cette petite protéine, en présence d’ATP, se liait covalemment à des protéines de haut poids moléculaire et que cette réaction était réversible. Ils ont alors imaginé un modèle où la liaison de APF-1 sur des substrats pouvait servir de signal de reconnaissance pour la protéase retenue sur la DEAE (Fig. 2). Ce modèle permettait d’expliquer à la fois la dépendance énergétique et la sélectivité du système. Il est frappant de constater le remarquable parallèle entre ce modèle initial (Fig. 2) et le modèle actuel (Fig. 1).

En 1980, APF-1 a été identifié comme étant l’ubiquitine et les années 1980-1990 ont vu la caractérisation de la cascade enzymatique d’ubiquitylation, avec l’identification des enzymes E1, E2 et E3, ainsi que la compréhension du mécanisme d’activation et de transfert de l’ubiquitine, puis la purification et la caractérisation, par plusieurs laboratoires, du protéasome 26S (responsable de la dégradation des substrats ubiquitylés) et enfin du protéasome 20S (le corps catalytique du 26S). C’est bien la découverte de l’ubiquitylation comme signal d’adressage des protéines pour la dégradation, qui a révolutionné ce domaine.
Par la suite, le début des années 90 a vu naître un intérêt pour la biologie du système UbPr, avec des études de génétique chez la levure en particulier, qui ont montré que l’ubiquitylation et le protéasome étaient essentiels. Dans le même temps, a eu lieu l’identification des premiers substrats du système UbPr chez les mammifères, tels que les cyclines, la protéine p53 et IkBa (IkappaB-alpha), qui est l’inhibiteur de la voie NFkB. Ces exemples sont d’ailleurs souvent cités comme substrats de référence. Depuis, la recherche dans le domaine a connu un essor exponentiel et, aujourd’hui, il est clair que la dégradation des protéines cellulaires est un mécanisme très complexe, contrôlé dans le temps et dans l’espace, d’une grande importance biologique.

Malgré ces très nombreuses avancées, qui ont justifié l’attribution en 2004 du prix Nobel de chimie aux découvreurs de l’ubiquitylation des protéines (Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose), de nombreuses « boîtes noires » existent encore dans notre compréhension du fonctionnement du système UbPr. En particulier, des questions centrales comme « comment s’effectue l’allongement de la chaîne de poly-ubiquitine ? », ou « comment fonctionne exactement le protéasome 26S ? », restent encore largement sans réponse précise.

L’ubiquitylation des protéines

L’ubiquitine et la cascade enzymatique d’ubiquitylation

L’ubiquitine est une petite protéine de 76 acides aminés, très stable, présente dans toutes les cellules eucaryotes. Elle est très conservée au cours de l’évolution parmi les différentes espèces eucaryotes : l’ubiquitine humaine et celle de levure partage 96 % d’identité pour leur séquence protéique.

Elle est toujours exprimée sous forme de précurseurs protéiques, soit en fusion N-terminale avec une autre protéine (souvent des protéines ribosomales), soit en une succession de plusieurs molécules d’ubiquitine fusionnées les unes aux autres. Pour rendre disponible l’ubiquitine, ses précurseurs doivent donc être clivés, ce qui est assuré par des enzymes de déubiquitylation ou DUB (pour DeUBiquitinating enzymes).
Dans ce mode d’expression, l’existence de précurseurs de l’ubiquitine et leur clivage subséquent permettent probablement d’établir un « contrôle qualité » afin d’éviter la production d’ubiquitine monomérique mal traduite ou mal conformée. Par ailleurs, les fusions ubiquitine-protéines ribosomales semblent aussi jouer un rôle important dans la biogénèse des ribosomes.

La conjugaison de l’ubiquitine aux substrats se fait par une cascade enzymatique impliquant au moins trois types de facteurs :

• le premier est l’enzyme d’activation de l’ubiquitine, ou E1, qui effectue l’activation ATP-dépendante de l’ubiquitine en formant une liaison thiol-ester à haute énergie entre la glycine C-terminale de l’ubiquitine (via le COOH porté par son carbone α) et le groupement thiol (SH) d’une cystéine de l’E1 ;

• le second est une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine, ou E2, sur lequel l’ubiquitine activée est transférée au niveau du groupement thiol de sa cystéine active ;

• enfin le troisième, l’E3, est un facteur habituellement, mais souvent incorrectement, appelé ubiquitine-ligase. Il favorise le transfert de l’ubiquitine de l’E2 vers le substrat par formation d’une liaison amide entre le groupement COOH de la glycine C-terminale de l’ubiquitine et le groupement ε-amine (amine portée sur la chaîne latérale de l’acide aminé et non par le carbone α, voir l’article « Les acides aminés ») d’une lysine du substrat, formant ainsi une liaison isopeptidique (Fig. 3).

Cependant, il a également été décrit que la conjugaison de l’ubiquitine sur le substrat pouvait se faire sur le groupement thiol d’un résidu cystéine ou sur le groupe hydroxyl (OH) d’une sérine ou d’une thréonine, et que, dans certains cas, l’ubiquitine peut être conjuguée non pas à une lysine interne de la protéine, mais au groupement α-amine du résidu N-terminal de la protéine, via une liaison peptidique.

Dans une réaction d’ubiquitylation, l’E3 est un facteur clé puisqu’il est impliqué dans la reconnaissance spécifique du substrat et est donc responsable de l’essentiel de la spécificité de la réaction. Ceci explique qu’il existe une très grande quantité d’E3s différentes, probablement des centaines chez les mammifères, alors que l’on ne compte qu’une trentaine d’E2s et que deux E1s.

Dans certains cas, la poly-ubiquitylation du substrat nécessite l’intervention d’un quatrième facteur, appelé E4, dont le mécanisme et le rôle exact ne sont pas encore bien compris (pour revue, voir Hoppe, 2005). Dans un cas décrit, ce facteur permet d’allonger et de modifier le type de chaîne (de K29 à K48) présent sur le substrat, permettant ainsi sa dégradation efficace par le protéasome.

Par ailleurs, l’ubiquitylation est un processus dynamique et réversible, du fait de l’existence de nombreuses enzymes de déubiquitylation ou DUB (Fig. 3) qui, en plus de permettre la maturation de l’ubiquitine à partir de ses précurseurs, clivent l’ubiquitine de ses substrats (protéines ou peptides associés au protéasome) et désassemblent les chaînes de poly-ubiquitine.

Les différentes familles d’ubiquitine-ligase

Les E3s forment un groupe vaste et varié de protéines qui sont généralement classées en 2 grandes familles : la famille des E3s à domaine HECT (pour Homologous to E6-associated protein C-Terminus), comportant une vingtaine de membres connus chez l’Homme, et celle des E3s à domaine RING (pour Really Interesting New Gene), comportant des centaines de membres (pour revue, voir Ardley & Robinson, 2005). Signalons qu’il existe également quelques E3s décrites dans la littérature qui ne rentrent pas dans ces deux familles.

Dans le cas des E3s à domaine HECT, le terme d’Ubiquitine-ligase est approprié, car elles jouent un rôle direct dans la conjugaison de l’ubiquitine au substrat. De fait, l’ubiquitine activée est transférée de l’E2 sur un résidu cystéine de l’E3, avant d’être conjuguée au substrat (Fig. 3).
Par contre, l’appellation d’Ubiquitine-ligase semble impropre pour les E3s à domaine RING qui, en l’état actuel des connaissances, sont des molécules d’échafaudage, mais pas de véritables enzymes. En effet, ces E3s servent de molécules adaptatrices entre l’E2 et le substrat pour faciliter l’ubiquitylation du substrat, en rapprochant celui-ci de l’E2. D’ailleurs, le motif « RING finger », qui les caractérise, forme des boucles stabilisées par coordination d’ions Zinc et permet le recrutement des E2s.

Les différents types d’ubiquitylation

Les protéines peuvent être modifiées soit par une seule ubiquitine (mono-ubiquitylation) soit par des chaînes de poly-ubiquitine (poly-ubiquitylation), sur un ou plusieurs résidus du substrat, au niveau d’une lysine le plus souvent ; on parle alors de multi-mono-ubiquitylation et de multi-poly-ubiquitylation, respectivement (Fig. 4).
Dans le cas de la poly-ubiquitylation, la première molécule d’ubiquitine est conjuguée à une lysine du substrat, puis l’élongation de la chaîne de poly-ubiquitine se fait par la formation d’une liaison isopeptidique entre la glycine C-terminale d’une nouvelle ubiquitine et une lysine de la molécule d’ubiquitine précédemment conjuguée. Comme toutes les lysines de l’ubiquitine sont exposées à sa surface, accessibles et disponibles, il peut se former différentes chaînes, de type et de topologie variés.
Il faut noter, à ce niveau, que la poly-ubiquitylation peut être impliquée dans d’autres voies que la protéolyse cellulaire, comme l’endocytose ou la réponse inflammatoire (pour revue, voir Mukhopadhyay & Riezman, 2007).
En plus de la poly-ubiquitylation, la mono-ubiquitylation joue également un rôle important dans des fonctions très variées, comme l’internalisation des récepteurs membranaires et le trafic des protéines ou encore le remodelage de la chromatine via la modification des histones.

Comme évoqué précédemment, l’ubiquitine contient 7 lysines (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63 ; Fig. 4) qui peuvent toutes être utilisées dans la formation de chaînes de poly-ubiquitine. Cela a été démontré par des analyses de spectrométrie de masse chez la levure, qui ont permis une quantification de l’abondance relative des différentes chaînes dans cet organisme (K48>K63>K11>K33=K29>K27>K6). Même si cela reste à démontrer, il est fort probable qu’il existe cette même diversité chez les eucaryotes supérieurs.

Compte tenu de la distribution des différentes lysines à la surface de l’ubiquitine, les chaînes ont une topologie très différente selon la lysine de l’ubiquitine utilisée pour la conjugaison. Effectivement, une étude de la structure de dimères d’ubiquitine conjugués, via une liaison isopeptidique, sur la lysine 48 ou la lysine 63, montre que le dimère Ub2-K48 a une structure très compacte, alors que le dimère Ub2-K63 a une structure « ouverte », comme représenté en Fig. 5.

Malgré une certaine confusion quant aux rôles spécifiques des différents types de chaîne, il ressort que la variété de leurs topologies, associée à leur reconnaissance par des effecteurs spécifiques, est sûrement responsable de la multitude des signaux transmis par les chaînes d’ubiquitine. Il existe en effet un très grand nombre de protéines possédant des domaines de liaison aux chaînes d’ubiquitine qui interviennent dans « l’aiguillage » des protéines ubiquitylées et donc dans la définition des conséquences de l’ubiquitylation.

Les récepteurs de l’ubiquitine : les protéines à UBD

L’ubiquitylation est une modification qui permet de médier des effets cellulaires aussi variés que la protéolyse, l’endocytose, la réparation de l’ADN, etc. Toutefois, les protéines peuvent être modifiées par l’ubiquitine de différentes façons : la mono-ubiquitylation et la poly-ubiquitylation, et dans ce dernier cas, différents types de chaîne peuvent être conjugués au substrat. Ces protéines ubiquitylées sont reconnues et prises en charge par des « récepteurs de l’ubiquitine » qui vont discriminer quel type d’ubiquitylation est associé au substrat et permettre leur orientation vers différentes voies cellulaires.
Ces récepteurs contiennent généralement plusieurs motifs d’interaction avec l’ubiquitine ou UBD (pour Ubiquitin Binding Domain) qui peuvent interagir de manière autonome avec l’ubiquitine. Ces récepteurs contiennent parfois des motifs d’interaction avec les substrats qui peuvent agir de concert avec les motifs UBD.

Les protéines à UBD regroupent des protéines diverses, telles que des E3s et des DUB, ou encore des sous-unités du protéasome. Certaines protéines à UBD peuvent également contenir un domaine UBL (pour UBiquitin Like), qui peut lui-même interagir avec des domaines UBD, au sein de la même protéine ou entre deux protéines distinctes. Cette structure confère à certaines protéines la propriété d’adresser des substrats ubiquitylés au protéasome, en interagissant avec les substrats ubiquitylés, via leurs domaines UBD, et avec le protéasome, via leurs domaines UBL.

Les protéines « ubiquitin-like »

En plus des domaines UBL que comportent certaines protéines et qui leur confèrent des propriétés similaires à l’ubiquitine, comme la liaison à des domaines UBD, il existe de nombreuses petites protéines homologues à l’ubiquitine, appelées les protéines « ubiquitin-like ».
Ces protéines sont caractérisées par une structure très similaire à celle de l’ubiquitine (Fig. 6) bien que certaines ont des séquences primaires très différentes, et sont, comme l’ubiquitine, traduites sous forme de précurseurs, en fusion avec d’autres protéines, puis clivées post-traductionnellement. De plus, ces protéines ont la caractéristique, comme l’ubiquitine, de pouvoir être conjuguées sur des résidus lysines de protéines substrats.
Comme l’ubiquitylation, la conjugaison de ces molécules « ubiquitin-like » dépend d’une cascade enzymatique impliquant une enzyme E1, qui active la protéine « ubiquitin-like » de manière ATP-dépendante, et une E2, qui transfère cette protéine activée sur le substrat. Dans la plupart des cas, une enzyme E3 peut intervenir pour faciliter la conjugaison de ces « ubiquitin-like ».
Enfin, comme pour l’ubiquitylation, la conjugaison de ces « ubiquitin-like » sur des substrats est réversible, et il existe des hydrolases spécifiques de chaque « ubiquitin-like ».

Il existe donc une grande variété d’étiquettes qui peuvent être conjuguées aux substrats avec la même spécificité que l’ubiquitine, et ces différentes modifications peuvent s’influencer entre elles, ce qui accroît la diversité des signaux menant des substrats spécifiques vers les différentes voies de signalisation. De plus la voie de l’ubiquitylation est conservée au niveau mécanistique pour les « ubiquitin-like ».

La déubiquitylation

La déubiquitylation est un processus aussi important dans la régulation du système ubiquitine que les régulations de la réaction d’ubiquitylation elle-même.
De fait, que ce soit pour ses rôles liés à la protéolyse ou ceux liés à la régulation post-traductionnelle, de la localisation ou de la fonction de certaines protéines, l’ubiquitylation doit être extrêmement bien contrôlée pour éviter des effets délétères. Aussi, de la même façon que la phosphorylation des protéines est en équilibre dynamique avec leur déphosphorylation, l’ubiquitylation des protéines est en permanence contrecarrée par leur déubiquitylation.
Par ailleurs, l’ubiquitine est une protéine très stable alors que les protéines auxquelles elle est conjuguée ont des durées de vie beaucoup plus courtes, ce qui implique qu’elle est normalement clivée de ses conjugués par les enzymes de déubiquitylation (DUB) avant ou pendant la dégradation du substrat.

Puisqu’elles sont capables de cliver l’ubiquitine, les DUB sont des protéases. Il en existe plusieurs familles qui jouent un rôle déterminant dans l’efficacité de la machinerie d’ubiquitylation, d’autant qu’elles permettent de recycler l’ubiquitine afin de maintenir un pool d’ubiquitine libre intracellulaire, nécessaire au maintien de la protéolyse. Elles sont donc essentielles dans le contrôle et le devenir des substrats ubiquitylés (pour plus de détails, voir les revues d’Amerik & Hochstrasser, 2004 et de Nijman et al, 2005).

Conclusions

Les notions introduites dans cette partie montrent que l’ubiquitylation est une réaction contrôlée à de nombreux niveaux :

• au niveau du substrat qui peut subir un certain nombre de modifications pour être reconnu par l’E3,

• au niveau de l’E3 dont l’activité peut être régulée par différents mécanismes,

• et au niveau des étapes post-ubiquitylation.

Au vu de la diversité des signaux générés par les différents types d’ubiquitylation, ajoutés à ceux dus aux « ubiquitin-like », on peut envisager de découvrir encore de nombreux rôles de ces modifications dans le ciblage de substrats au niveau des différentes voies de signalisation.

Le protéasome

Le protéasome 20S

Le protéasome 20S est le cœur protéolytique des différentes formes de protéasome. Cependant, bien que le protéasome 20S seul peut hydrolyser de petits peptides et certaines protéines dépliées, il ne peut pas dégrader de véritables substrats poly-ubiquitylés, pour lesquels il a besoin d’être associé à son régulateur 19S.

Composition et structure

Le protéasome 20S est un complexe multi-protéique d’environ 700 kDa. Sa structure a été déterminée par microscopie électronique puis par cristallographie, ce qui a révélé un cylindre creux, de 15 nm de long et de 11 nm de diamètre, composé de 28 sous-unités assemblées en 4 anneaux heptamériques distincts, identiques 2 à 2, empilés dans une symétrie C2. Les 2 anneaux externes sont formés de 7 sous-unités α et les 2 anneaux internes de 7 sous-unités β, qui portent les activités catalytiques (Fig. 7).
Chez l’archaebactérie Thermophila acidophilum, le protéasome 20S se compose de 14 copies de chacune des 2 sous-unités α et β (α7β7β7α7), alors que chez les eucaryotes, il est construit à partir de 2 copies de 7 sous-unités α et 7 sous-unités β différentes, mais présentant de fortes homologies de séquences (α1-7β1-7β1-7α1-7).
Les 2 anneaux bêta délimitent la cavité interne, tandis que les cavités externes (appelées « antichambres ») sont délimitées par un anneau alpha et un anneau bêta. Cette structure favoriserait la rétention des substrats à l’intérieur du cylindre et jouerait de ce fait un rôle déterminant dans la processivité du protéasome.
Même si la composition du protéasome 20S des eucaryotes est plus complexe que celui des archaebactéries, en raison de l’augmentation du nombre des différentes sous-unités au cours de l’évolution, la structure quaternaire de ces complexes est très similaire.

Chez les archaebactéries, toutes les sous-unités β sont identiques, ce qui fait 14 sites catalytiques actifs au total. Chez les eucaryotes, seules 3 des 7 sous-unités β (β1, β2 et β5) possèdent une activité protéolytique, ce qui signifie que chaque protéasome possède 6 sites catalytiques (Fig. 7b, représentés en jaune).
Le site actif est toujours caractérisé par un résidu thréonine dont le groupement amine sert de nucléophile dans le cycle catalytique. Cependant, les sites catalytiques présentent des spécificités distinctes, définies par la nature physico-chimique de l’environnement des sites actifs. Ainsi, les sous-unités β2 qui présentent un environnement acide où vont se loger des résidus basiques, possèdent une activité trypsin-like qui coupe après les résidus basiques. Les sous-unités β5 possèdent une activité chymotrypsin-like qui coupe après les résidus hydrophobes. Les sous-unités β1 possèdent une activité caspase-like qui coupe après les résidus acides.

Chez les mammifères, un traitement à l’interféron γ stimule l’expression de 3 sous-unités β actives supplémentaires, appelées les sous-unités β induites, βi, ou LMP. Chacune d’elles va remplacer une sous-unité β constitutive spécifique, qui lui est génétiquement homologue, et être incorporée à la position correspondante à l’intérieur de l’anneau β du nouveau protéasome assemblé. La sous-unité β1i/LMP2 remplace son homologue exprimé constitutivement β1, β5i/LMP7 remplace β5 et β2i/LMP10 (MECL1) remplace β2. Le protéasome ainsi formé, suite à un signal de l’interféron γ, est appelé « immuno-protéasome »: il génère des peptides dont la taille est mieux appropriée pour la présentation des antigènes (en moyenne 8 à 11 acides aminés au lieu de 6 à 8 en moyenne) par les molécules du CMH de classe I.

Ouverture du pore

Chez les eucaryotes, les extrémités N-terminales des sous-unités α forment un réseau d’interactions entre elles et constituent ainsi une barrière physique qui obstrue l’entrée du canal et limite l’accès des protéines cytosoliques à l’intérieur de la chambre protéolytique, en imposant une conformation fermée au protéasome. La sous-unité α3 semble être particulièrement impliquée dans la fermeture du pore. En effet, son extrémité N-terminale forme une sorte de pont qui traverse le pore, et elle est en contact avec toutes les autres extrémités N-terminales. De plus, des analyses cristallographiques du protéasome 20S de S. cerevisiae ont montré que la délétion de l’extrémité N-terminale de la sous-unité α3 ouvre un canal vers la cavité catalytique interne du protéasome 20S, levant ainsi la répression de l’hydrolyse peptidique.

L’activation du protéasome 20S nécessite donc un réarrangement de ces extrémités.
Effectivement, in vitro, il est possible d’activer artificiellement le 20S par différents traitements, comme une incubation prolongée à 37 °C, un chauffage à 55 °C, une incubation avec des faibles concentrations de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, un détergent) ou avec des acides gras. Ces traitements induisent probablement des changements de conformation des protéines qui altèrent les anneaux alpha et facilitent l’entrée des substrats. Par ailleurs, il a également été montré que certaines protéines non repliées étaient capables d’ouvrir l’accès à la chambre protéolytique en absence d’activateurs, probablement via des interactions non-spécifiques avec des motifs hydrophobes de leurs séquences.

Les extrémités N-terminales des sous-unités α correspondent également aux sites de liaison avec les complexes régulateurs qui modulent l’activité protéolytique du protéasome, en rendant accessible l’intérieur du complexe et en levant ainsi l’inhibition due à ces extrémités N-terminales. Il existe en effet plusieurs régulateurs du protéasome 20S capables de s’associer à ce complexe et de modifier ses activités catalytiques, notamment les régulateurs PA28/11S et le complexe 19S (voir ci-dessous).

La structure cristallographique du complexe 20S-11S a permis de montrer que l’association du corps protéolytique avec son activateur engendre un réarrangement des extrémités N-terminales des sous-unités α, qui, ainsi, n’obstruent plus le pore, mais sont dressées à l’intérieur de l’activateur, ce qui ménage un accès au canal du 20S (Fig. 8).

Les différents régulateurs

Comme évoqué précédemment, il existe des activateurs du protéasome 20S en absence desquels les extrémités du 20S sont fermées et l’activité du protéasome réprimée. Ces régulateurs positifs sont les complexes 19S (ou PA700), 11S (ou PA28), et PA200 (où PA signifie Proteasome Activator) qui, en s’associant aux extrémités du 20S, au niveau de l’anneau des sous-unités alpha du 20S, vont permettre l’ouverture des canaux et donc l’activation du 20S (Fig.9).

Les données structurales obtenues pour ces régulateurs du protéasome montrent qu’ils sont traversés par un pore ou un canal qui va se positionner dans le prolongement du canal du 20S. Pour PA28 (ou 11S), les données cristallographiques le montrent très clairement (Fig. 8 et 9b). En ce qui concerne PA200, des données de microscopie électronique prédisent un agencement en solénoïde dont le pore pourrait se positionner dans le prolongement du canal du 20S (Fig. 9e). Pour le 19S (ou PA700), cet agencement semble concerner au moins le sous complexe appelé « base ».

Ces données de structure sont en faveur d’un rôle de ces activateurs dans la régulation du 20S. Néanmoins, seul le complexe 19S, associé au 20S, formant ainsi le protéasome 26S, est considéré comme étant impliqué dans la dégradation de substrats ubiquitylés ou non. Les autres régulateurs, PA28 et PA200, semblent jouer d’autres rôles puisqu’ils sont décrits comme étant uniquement capables d’activer la dégradation de peptides par le protéasome 20S, mais pas celle de protéines. Mais certains résultats laissent entrevoir d’autres rôles possibles.

Le protéasome 26S

Le protéasome 26S, formé par l’association du corps catalytique 20S avec un ou deux complexes régulateurs 19S, est impliqué dans la dégradation des substrats, ubiquitylés ou non, dépendante de l’ATP. Le complexe régulateur 19S, un complexe macromoléculaire de 900 kDa, prend en charge plusieurs rôles dans la régulation de l’activité du protéasome :

1. la reconnaissance des substrats (ubiquitylés ou non) ;

2. la déubiquitylation des substrats ubiquitylés pour recycler l’ubiquitine ;

3. la dénaturation des substrats ;

4. l’ouverture du canal ;

5. la translocation des substrats dans le 20S.

Il est possible que le 19S joue également un rôle dans la sortie des peptides digérés. De plus, le 19S, tout comme les autres régulateurs du 20S, pourrait jouer un rôle dans la localisation du protéasome, mais ces deux dernières pistes ont été très peu étudiées.

Composition et structure du 19S

Le complexe 19S n’a pas pu être cristallisé, ni seul, ni en association avec le 20S. Sa structure exacte n’est donc pas connue. De plus, le nombre exact des sous-unités du 19S dans les différents organismes est inconnu, car il n’est pas exclu que certaines sous-unités se lient transitoirement et/ou puissent être perdues en fonction des procédures de purification utilisées, qu’elles soient en quantité substoechiométrique ou encore qu’elles soient spécifiques des espèces. Néanmoins, à quelques exceptions près, la composition des sous unités du 19S entre différentes espèces est remarquablement similaire. Pour désigner ces sous-unités, deux nomenclatures sont couramment utilisées, la nomenclature « S » des mammifères (où « S » signifie Subunit) et la « Rp » de S. cerevisiae (où « Rp » signifie Regulatory Particle) où l’on distingue les « Rpt » pour les ATPases et les « Rpn » pour les sous-unités non ATPases. Par ailleurs, la structure analysée par microscopie électronique, combinée à des études de mutagénèse chez la levure ont montré que ce complexe se compose de 2 sous-complexes : la « base », qui contient 6 ATPases (Rpt1 à Rpt6) et 3 sous-unités non-ATPasiques, Rpn1, Rpn2 et Rpn10, et le « couvercle » qui contient 9 sous-unités, toutes non ATPasiques (Rpn3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 et Rpn15) (Fig.10). Une autre sous-unité, Rpn13, est considérée comme une sous-unité intrinsèque du 19S, jouant un rôle important dans la reconnaissance des substrats ubiquitylés, mais son appartenance à la base ou au couvercle n’a pas encore été déterminée. Enfin, une sous-unité additionnelle, la sous-unité S5b, qui interagit in vitro avec les sous-unités Rpn1/S2, Rpt2/S4 et Rpt1/S7, est présente dans le complexe de mammifère.

La base

Le protéasome 20S associé à la base du 19S est suffisant pour la dégradation dépendante de l’ATP des substrats non ubiquitylés, mais ce complexe est incapable de dégrader des substrats ubiquitylés, ce qui suggère un rôle de la base dans le dépliement des substrats et dans leur translocation au travers du canal du 20S et un rôle du couvercle dans la reconnaissance des substrats ubiquitylés et dans la déubiquitylation de ces substrats.

Le couvercle

Le couvercle est nécessaire pour la dégradation des substrats ubiquitylés, en assurant la reconnaissance des substrats et/ou leur déubiquitylation, par clivage des chaînes d’ubiquitine via la(es) isopeptidase(s) du couvercle (voir plus loin). En outre, il joue également un rôle au niveau de la structure puisqu’il ménage une cavité à l’intérieur du 19S, probablement pour permettre un positionnement du substrat favorable à sa dénaturation et à sa translocation dans le 20S par la base.

Si la structure du couvercle n’a pas encore été déterminée, la combinaison de plusieurs études (approches double-hybride, expériences de pontage chimique couplées à la spectrométrie de masse, données génétiques et biochimiques) ont permis de proposer un modèle détaillé de l’organisation du couvercle (Fig.11).

Reconnaissance des substrats

La majorité des substrats du protéasome sont étiquetés par une chaîne de poly-ubiquitine, qui joue probablement un rôle important dans la reconnaissance des substrats par le protéasome (Fig.12a). La sous-unité Rpn10 de la base du 19S est capable d’interagir avec les chaînes d’ubiquitine impliquant les lysines K48 et K63 de l’ubiquitine, avec la même affinité. L’affinité est augmentée lorsque la taille de la chaîne d’ubiquitine augmente, avec un minimum de 4 molécules d’ubiquitine, ce qui peut s’expliquer par l’organisation des chaînes de poly-ubiquitine en modules de tétra-ubiquitine qui pourraient servir d’unités de reconnaissance par le protéasome. Néanmoins, si la spécificité de Rpn10 pour les chaînes longues de préférence est similaire à celle du 19S, en absence de Rpn10, le protéasome est toujours capable de lier les conjugués d’ubiquitine, ce qui est en accord avec l’existence de récepteurs d’ubiquitine additionnels intrinsèques au protéasome. D’ailleurs, il semblerait qu’une ATPase, la sous-unité Rpt5, soit capable de lier la chaîne d’ubiquitine, même si le motif d’interaction de Rpt5 avec l’ubiquitine reste à identifier. Dans ce cas, vu son appartenance à la base, Rpt5 ne fonctionnerait pas en parallèle de Rpn10 ou d’autres récepteurs de l’ubiquitine, mais plutôt en aval. En outre, la sous-unité Rpn13 du 19S a également été caractérisée comme un récepteur à l’ubiquitine.

Par ailleurs, certaines sous-unités doivent être capable d’interagir avec des substrats indépendamment de l’ubiquitine puisque la dégradation de certains substrats du protéasome ne nécessitent pas leur ubiquitylation préalable, comme c’est le cas pour ODC, p21 ou encore c-fos. La base pourrait servir de plateforme d’interaction avec les substrats du protéasome et permettrait leur positionnement adéquat pour les étapes suivantes de dénaturation et de translocation. En effet, des études sur les protéasomes eucaryotes ont montré que la base peut interagir avec des substrats non-ubiquitylés dénaturés et le complexe archaebactérien PAN interagit avec des protéines natives/repliées et est capable de les dénaturer.

En conclusion, le protéasome 26S peut reconnaître ses substrats à la fois via des récepteurs intrinsèques (Rpn10, Rpn13 et Rpt5) mais aussi des récepteurs extrinsèques qui s’associent de façon réversible et transitoire avec le protéasome, et il n’est pas impossible qu’un substrat soit reconnu de manière coordonnée par plusieurs récepteurs.

Dénaturation des substrats

Les substrats doivent être dénaturés pour être transférés à l’intérieur du 20S (Fig.12b et c), car, même une fois ouvert, le canal du 20S est encore trop étroit pour laisser entrer des protéines sous leur forme native. Outre le besoin d’ATP pour l’association du 19S et du 20S, la protéolyse des protéines par le protéasome nécessite l’hydrolyse d’ATP. Par homologie avec les protéines chaperones, on peut penser que cette énergie permet des cycles de haute et de basse affinité du 19S pour les substrats, permettant ainsi de les maintenir dans une conformation dénaturée pour qu’ils puissent être transférés à l’intérieur du 20S. Ces fonctions (dépliement et translocation des substrats) sont probablement assurées par la base, du fait de sa localisation et de la présence des 6 ATPases à son niveau. Cette hypothèse est soutenue par le fait que le 20S associé à la base est aussi efficace que le 26S pour la dégradation des substrats non-ubiquitylés et par homologie avec le complexe PAN qui est capable de dénaturer des substrats non ubiquitylés et de les transloquer dans le 20S de manière ATP-dépendante. Il faut noter que pour des substrats non ubiquitylés et non structurés, tels que p21 et la caséine, il a été montré que leur dégradation ne nécessitait pas l’hydrolyse de l’ATP, suggérant que le transit de ces protéines aux sites catalytiques se fait par un processus passif et que la translocation par elle-même ne nécessite pas d’être couplée à l’hydrolyse de l’ATP. De même, chez les archaebactéries, l’association du 20S et du complexe PAN ainsi que la dégradation de protéines non structurées ne nécessite pas l’hydrolyse de l’ATP.

D’autre part, des études faites in vitro montrent que la base du protéasome eucaryote peut lier des protéines dénaturées et les relarguer de manière ATP-dépendante, mais peut aussi les renaturer, ce qui dénote des propriétés chaperones, et laisse présager de leur capacité à dénaturer les protéines natives. Toutefois, malgré les activités chaperone-like intrinsèques du protéasome, de nombreux résultats montrent que des protéines chaperones agissent de concert avec le protéasome pour son bon fonctionnement, comme c’est le cas pour la protéine Hsp90 qui est souvent copurifiée avec le protéasome. Ces chaperones peuvent promouvoir l’ubiquitylation de substrats mal repliés et aider à l’adressage et la présentation des substrats au protéasome.

Déubiquitylation des substrats

Une fois reconnu par le protéasome 26S, le substrat poly-ubiquitylé est déplié et transloqué au travers du canal du 20S vers la cavité protéolytique. De façon concomitante, le substrat est déubiquitylé (Fig.12f). Comme évoqué précédemment, la déubiquitylation des substrats au niveau du protéasome est importante pour plusieurs raisons, non seulement pour le recyclage de l’ubiquitine, mais également du point de vue du fonctionnement du protéasome. De fait, la chaîne formée de 4 ubiquitines qui constitue, dans la majorité des cas, le signal minimal de dégradation, a un diamètre d’environ 28 Å, alors que le diamètre du pore axial du protéasome 20S n’excède pas 20 Å : sans la déubiquitylation, cette chaîne bloquerait la translocation du substrat à l’intérieur du 20S. De plus, les chaînes libres d’ubiquitine doivent être éliminées : sans cela, elles pourraient inhiber le protéasome 26S en entrant en compétition avec les substrats ubiquitylés. Ainsi, la déubiquitylation doit être étroitement couplée à la dégradation et plusieurs activités de déubiquitylation ont été identifiées comme associées au protéasome.

Ouverture du pore

La délétion de la queue N-terminale de la sous-unité α3 décrite précédemment, si elle active fortement le protéasome 20S, n’a pas d’effet notoire sur le 26S, ce qui suggère que le 19S joue bien un rôle dans l’ouverture du 20S. Cet effet a été imparti aux ATPases du 19S, Rpt2 et Rpt5, via leur motif conservé HbYX (pour Hydrophobic-Tyrosine-X) au niveau de leurs extrémités C-terminales, qui permet l’ouverture du canal du 20S via un mécanisme différent que celui opéré par le régulateur 11S.

Autres rôles du 19S et/ou du 26S

Un autre rôle intéressant du protéasome est son activité de « processing ». En effet, dans certains cas, le protéasome ne dégrade pas entièrement le substrat, mais permet la production d’une forme tronquée du précurseur. Cette activité est un mécanisme de régulation qui permet de faire passer une protéine d’une forme à une autre, et modifier ainsi ses activités cellulaires.

L’exemple le plus documenté est celui du précurseur p105 de la protéine p50, un constituant du facteur de transcription NF-kB. Dans un premier temps, la protéine p105 est ubiquitylée, au niveau de son extrémité C-terminale, puis dans un second temps, la moitié C-terminale est dégradée par le protéasome, et enfin, la région N-terminale de 50 kDa est relâchée comme une sous-unité stable et active du facteur de transcription NF-kB. La région riche en glycines (GRR pour Glycin-Rich Region) située au milieu de la protéine p105 pourrait servir de “signal” pour la dégradation partielle de la protéine. Cette séquence et les interactions spécifiques de certains acides aminés au niveau du domaine p50, qui stabilisent la structure tridimensionnelle et empêchent sa dénaturation, permettent de déterminer quelle région doit être dégradée. Il existe d’autres exemples de maturation protéolytique, comme celui du précurseur p100 de la protéine NF-kB2 ou celui du précurseur p120 du facteur de transcription Spt23, ce qui montre que ce mécanisme occupe une place importante dans les fonctionnalités du protéasome.

Par ailleurs, d’autres fonctions non protéolytiques de type chaperon ou d’ancrage qui pourraient participer aux régulations de l’organisation de la chromatine ou au recrutement de facteurs de transcription ont été attribuées au protéasome 26S et plus particulièrement aux sous-unités ATPases du complexe régulateur 19S. On trouve par exemple le protéasome impliqué dans le désassemblage et le réarrangement du complexe de réparation d’excision nucléaire, indépendamment de la protéolyse et les sous-unités du 19S qui colocalisent in vivo avec les protéines chaperones aux sites des agrégats de récepteurs aux androgènes mal repliés.

Les complexes 20S-11S

Composition et structure du 11S

L’activateur du protéasome 11S a initialement été découvert dans des lysats de cellules sanguines humaines et bovines comme un facteur capable d’activer fortement l’hydrolyse de petits peptides fluorogéniques, mais incapable de stimuler la dégradation de protéines natives, ubiquitylées ou non. Toutefois, pour certains peptides, la stimulation du protéasome 20S par l’activateur 11S peut avoisiner les 50 fois, ce qui suggère un rôle important de cet activateur sur l’activité du protéasome. Cet activateur 11S regroupe en fait une famille de protéines de 28 kDa dénommés PA28 ou 11S REG qui comprend trois membres homologues : PA28 α, PA28 β et PA28 γ (Fig. 13).

Bien que les propriétés biochimiques de PA28 soient connues, ses rôles précis sont peu clairs et controversés. L’absence de PA28 chez la levure suggère que PA28 ne participe pas à un processus cellulaire fondamental, mais qu’il contribue probablement à une fonction biologique propre aux eucaryotes supérieurs. La localisation de PA28 αβ au niveau des tissus immuns, son induction par l’interféron gamma et sa capacité à stimuler l’hydrolyse des peptides par le protéasome semblent indiquer un rôle de PA28 αβ dans la réponse immune et notamment dans la génération et la présentation des peptides antigéniques, ce qui semble beaucoup moins clair pour PA28 γ.

PA28 αβ : rôle dans la réponse immune

L’immunité chez les vertébrés implique deux voies distinctes : la réponse humorale, caractérisée par des anticorps circulants dirigés contre des épitopes générés dans les endosomes et présentés par les molécules du CMH de classe II, et la réponse cellulaire, médiée par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL), qui détruisent les cellules infectées, après reconnaissance de celles-ci grâce aux épitopes étrangers générés dans leur cytosol et présentés à leur surface par les CMH de classe I. Cette classe de peptides, d’une taille optimale de 8 à 11 résidus, est essentiellement générée par le protéasome. Après leur production par le protéasome, ils sont ensuite transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique où ils sont pris en charge par les molécules du CMH de classe I pour être exposés à la surface de la cellule. Comme évoqué précédemment, les corrélations entre induction à l’interféron gamma et localisation dans les tissus immuns des complexes PA28 αβ, suggèrent un rôle de ces complexes dans la présentation des antigènes.

Trois théories quant au rôle que PA28 αβ pourrait jouer dans la réponse immune ont été développées.

La première porte sur un changement de la taille des peptides générés : le protéasome est capable de générer des peptides d’une taille allant de 3-4 à plus de 30 acides aminés, avec néanmoins une prédominance de peptides de 6-8 résidus, ce qui est trop court pour une liaison efficace sur les molécules du CMH de classe I. Etant donné que la structure du protéasome 20S-11S montre que l’association avec PA28 αβ augmente le diamètre de l’ouverture de l’anneau alpha du protéasome, ceci pourrait faciliter la sortie de peptides plus longs (Fig.14b). Cependant, une étude a montré que PA28 αβ n’augmente pas la taille des peptides générés par le protéasome 26S.

La deuxième porte sur une altération des sites de clivage : l’association avec PA28 αβ, en imposant des changements de conformation importants et en modifiant de manière allostérique la spécificité des sites catalytiques, pourrait modifier les sites de clivage par le protéasome au sein d’un polypeptide, générant ainsi des épitopes uniques (Fig. 14a).

Enfin, la troisième porte sur l’assemblage de l’immuno-protéasome : PA28 αβ favoriserait l’assemblage de l’immuno-protéasome, mais ce dernier point est assez controversé, au vu des résultats obtenus par deux études d’inactivation des gènes PA28 α et β chez la souris. Chez un groupe, il a été observé une déficience importante de la réponse immune médiée par les CTL, associée à une très forte diminution de la proportion d’immuno-protéasome, suggérant un rôle de PA28 αβ dans le recrutement des sous-unités βi pour l’assemblage de l’immuno-protéasome. Chez l’autre groupe, la réponse immune n’est quasiment pas affectée et la composition en immuno-protéasome correcte, avec toutefois, une déficience dans la production de certains épitopes. Enfin, le fait que la surexpression de PA28 αβ dans des fibroblastes ait un effet positif sur la présentation des antigènes, indépendamment de la quantité d’immuno-protéasome, semble infirmer le rôle de PA28 αβ dans l’assemblage de l’immuno-protéasome. Par contre, des travaux ont montré, par l’étude du rôle de Hsp90 dans la production d’un épitope particulier, dans des cellules PA28 αβ-/- et PA28 αβ+/+, que la protéine Hsp90 et le complexe PA28 αβ pouvaient tous deux servir de chaperones et assurer la prise en charge et le transfert des peptides issus du protéasome aux molécules du CMH de classe I au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique (Fig. 14c).

Si plusieurs corrélations sont en faveur d’un rôle du complexe PA28 αβ dans la présentation des antigènes de classe I, les nombreuses études menées à ce sujet n’ont pas permis de clarifier ni son rôle exact dans cette voie, ni des propriétés spécifiques des complexes 20S-PA28 αβ par rapport au 26S. Par ailleurs, les complexes PA28 n’étant pas considérés comme capables de dégrader des protéines, leurs fonctions sont élaborées sur le modèle de protéasomes hybrides, où un complexe 19S à une extrémité contrôle l’accès des substrats protéiques aux sites catalytiques, et un complexe PA28 αβ à l’autre extrémité augmente l’efficacité de la protéolyse et contrôle le devenir des produits de dégradation et/ou la localisation du complexe. Cependant dans la cellule, il existe des complexes 11S-20S-11S, dans lesquels les deux extrémités du 20S sont associés à un 11S dont on imagine mal la fonction du fait qu’ils sont incapables de dégrader des protéines ubiquitylées in vitro. Ces conclusions sont sans compter que PA28 αβ pourrait avoir des fonctions indépendantes de la réponse immune, étant donné que les taux de PA28 αβ peuvent être affectés dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques qui ne semblent pas être liées à la réponse immunitaire.

PA28 γ

Contrairement aux nombreuses données relatives aux fonctions de PA28 αβ dans la réponse immune, les propriétés de PA28 γ ne semblent pas le prédisposer à une fonction particulière, même si un rôle dans la progression du cycle cellulaire et dans l’apoptose est envisagé.

Il est clair que si le complexe 19S se compose de sous-unités essentielles à la dégradation des protéines, les complexes PA28 en sont dépourvus et il est difficile d’envisager comment ils pourraient activer les fonctions protéolytiques du 20S contre des protéines de manière autonome, même s’ils activent l’ouverture du pore. Ainsi, si certaines voies dans lesquelles les complexes PA28 interviennent ont pu être identifiées, les mécanismes d’action de ces complexes sont loin d’être compris.

Localisation des protéasomes

Le rôle majeur de la dégradation dépendante du système UbPr nécessite que ce système soit très finement régulé. Cette régulation se fait en partie par l’étiquetage des protéines avec des chaînes particulières d’ubiquitine et par l’association du protéasome avec ses différents régulateurs, mais la localisation cellulaire du protéasome semble aussi être un point majeur de sa régulation. Aussi, si le protéasome est ubiquitaire et abondant, de nombreuses études ont montré qu’il pouvait avoir des localisations particulières, importantes pour ses fonctions. Ces études ont montré que le protéasome a une localisation nucléo-cytoplasmique, essentiellement diffuse, avec exclusion vacuolaire et nucléolaire, à certaines exceptions près.

Distribution nucléaire

Il existe des structures subnucléaires, appelés clastosomes, où on trouve du protéasome 20S, son complexe régulateur 19S, de l’ubiquitine et un certain nombre de substrats du système UbPr. Le nombre de ces structures, faible en conditions normales, est augmenté lorsque la protéolyse dépendante du protéasome est activée. Par contre, ces structures disparaissent suite au traitement des cellules avec des inhibiteurs du protéasome. Par ailleurs, des complexes 20S-PA28 γ sont présents au niveau des speckles nucléaires (structures subnucléaires enrichies en facteurs d’épissage des ARN), où ils semblent impliqués dans l’organisation de ces structures nucléaires.

Distribution cytoplasmique

Au niveau du cytoplasme, on trouve du protéasome et des substrats du protéasome concentrés dans une région entourant le centrosome. Cette région a même été proposée comme étant un lieu préférentiel de la dégradation protéasomale et, de ce fait, a été appelée « centre protéolytique ». Par la suite, il a été montré que des agrégats de protéasomes et de substrats ubiquitylés du protéasome, appelés « aggrésomes », se formaient à ce niveau, suite à une inhibition du protéasome ou à une surexpression de substrats du protéasome. Cet aggrésome permettrait de regrouper les protéines délétères afin de limiter leurs effets toxiques dans la cellule. Toutefois, l’activité du protéasome au niveau de cette structure semble inhibée et la concentration de protéasome à ce niveau ne serait que la conséquence du fait que ces protéines sont des substrats du système UbPr. Chez la levure, il a été montré que, lorsque les cellules entrent en quiescence, les sous-unités du protéasome se relocalisent massivement du noyau dans des structures cytoplasmiques mobiles, qui servent de réservoirs cytoplasmiques de protéasomes, qui peuvent être rapidement mobilisés lorsque les cellules sortent de quiescence.

Le protéasome semble s’accumuler dans des régions particulières : une fraction du protéasome cytoplasmique est étroitement associée à différents éléments du cytosquelette, en particulier aux filaments intermédiaires. Une fraction du protéasome est également associée au niveau de la surface externe du réticulum endoplasmique, où il est probablement impliqué dans le système ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation), qui consiste en un processus d’export rétrograde de protéines du réticulum endoplasmique mal conformées ou anormales vers le cytosol, couplé à leur ubiquitylation et leur dégradation par le protéasome. De manière intéressante, la fraction de protéasome associée à ce niveau est enrichie en immuno-protéasome, ce qui est cohérent avec le modèle de prise en charge directe des peptides délivrés par l’immuno-protéasome par le transporteur TAP, qui transporte les peptides dans la lumière du réticulum endoplasmique, où ils s’associent avec les molécules du CMH de classe I.

Le cas particulier de la mitose

Au cours de la mitose, on a vu que le protéasome se redistribue suite à la rupture de l’enveloppe nucléaire, mais il occupe également des localisations particulières : au début de la prophase, il s’accumule autour des chromosomes condensés, avec exclusion de la chromatine tout au long de la mitose, puis il se localise au niveau du fuseau mitotique. En effet, il s’associe aux pôles du fuseau au cours de la métaphase et de l’anaphase, puis au « mid-body » au cours de la télophase. Cette localisation semble corrélée avec la dégradation de la cycline B au cours du cycle.

Localisation du protéasome et type cellulaire

Enfin, il a été rapporté un certain nombre de localisations remarquables du protéasome selon le type cellulaire et son état de différenciation (exemple des myoblastes au cours de la différenciation musculaire, ou des différents types de cellules du système nerveux central), ce qui suggère que la distribution intracellulaire du protéasome refléterait le besoin d’une protéolyse augmentée et/ou diminuée de substrats spécifiques au niveau des différentes régions intracellulaires, même si on ne peut exclure une fonction non-protéolytique de ces protéasomes.

Bibliographie

• Amerik AY, Hochstrasser M (2004) Mechanism and function of deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta 1695(1-3) : 189-207
• Ardley HC, Robinson PA (2005) E3 ubiquitin ligases. Essays Biochem 41 : 15-30
• Baumeister W, Walz J, Zuhl F, Seemuller E (1998) The proteasome : paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell 92(3) : 367-380
• Coux O, Tanaka K, Goldberg AL (1996) Structure and Functions of the 20S and 26S Proteasomes. Annual Review of Biochemistry 65 : 801-847
• Groll M, Clausen T (2003) Molecular shredders : how proteasomes fulfill their role. Curr Opin Struct Biol 13(6) : 665-673
• Hershko A, Ciechanover A, Heller H, Haas AL, Rose IA (1980) Proposed role of ATP in protein breakdown : conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A 77(4) : 1783-1786
• Hicke L, Schubert HL, Hill CP (2005) Ubiquitin-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol 6(8) : 610-621
• Hoppe T (2005) Multiubiquitylation by E4 enzymes : 'one size' doesn't fit all. Trends in biochemical sciences 30(4) : 183-187
• Hurley JH, Lee S, Prag G (2006) Ubiquitin-binding domains. Biochem J 399(3) : 361-372
• Mukhopadhyay D, Riezman H (2007) Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling. Science 315(5809) : 201-205
• Nijman SM, Luna-Vargas MP, Velds A, Brummelkamp TR, Dirac AM, Sixma TK, Bernards R (2005) A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell 123(5) : 773-786
• Ortega J, Bernard Heymann J, Kajava AV, Ustrell V, Rechsteiner M, Steven AC (2005) The Axial Channel of the 20S Proteasome Opens Upon Binding of the PA200 Activator. J Mol Biol 346(5) : 1221-1227
• Pickart CM, Cohen RE (2004) Proteasomes and their kin : proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol 5(3) : 177-187
• Pickart CM, Fushman D (2004) Polyubiquitin chains : polymeric protein signals. Current opinion in chemical biology 8(6) : 610-616
• Ravid T, Hochstrasser M (2008) Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nat Rev Mol Cell Biol 9(9) : 679-690
• Rechsteiner M, Hill CP (2005) Mobilizing the proteolytic machine : cell biological roles of proteasome activators and inhibitors. Trends in cell biology 15(1) : 27-33
• Sharon M, Taverner T, Ambroggio XI, Deshaies RJ, Robinson CV (2006a) Structural Organization of the 19S Proteasome Lid : Insights from MS of Intact Complexes. PLoS Biol 4(8) : e267
• Simpson MV (1953) The release of labeled amino acids from the proteins of rat liver slices. The Journal of biological chemistry 201(1) : 143-154
• Unno M, Mizushima T, Morimoto Y, Tomisugi Y, Tanaka K, Yasuoka N, Tsukihara T (2002) The Structure of the Mammalian 20S Proteasome at 2.75 A Resolution. Structure (Camb) 10(5) : 609-618.
• Welchman RL, Gordon C, Mayer RJ (2005) Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals. Nat Rev Mol Cell Biol 6(8) : 599-609
• Zwickl P, Baumeister W (1999) AAA-ATPases at the crossroads of protein life and death. Nat Cell Biolog 1(4) : E97-E98